Le jeune reporter Rouletabille, réputé pour avoir démêlé de dures énigmes, se rend au Château du Glandier pour y éclaircir une agression. Il emmène son ami l’avocat Sainclair — le narrateur de l’histoire. Le château appartient au professeur Joseph Stangerson, un physicien de renommée qui y mène des expériences avec sa fille Mathilde, la victime du crime. Celle-ci a été retrouvée plus morte que vive dans la chambre peinte en jaune adjacente au laboratoire, dont la porte est fermée de l’intérieur et les volets clos.